Como a conta funciona
A grade da câmara de Neubauer melhorada mede 3 mm por 3 mm e fica 0,1 mm abaixo da lamínula. Por isso cada quadrado grande, de 1 mm por 1 mm, guarda 0,1 mm³ de líquido, o mesmo que 0,1 µL.
Sabendo a área contada e a profundidade, você sabe o volume em que as células estavam. Divida o total contado por esse volume e terá as células por µL da amostra diluída. Multiplique pela diluição e terá as células por µL da amostra original.
Com 150 leucócitos nos 4 quadrados grandes dos cantos e diluição 1:20, o volume é 4 × 0,1 = 0,4 µL. Então 150 ÷ 0,4 × 20 = 7.500 leucócitos por µL. Como 1 µL é 1 mm³, são também 7.500 por mm³, ou 7,5 × 10⁹ por litro.
Células por µL = total contado × diluição ÷ (área contada em mm² × 0,1 mm)
A grade da câmara
- Área total: 9 quadrados grandes de 1 mm de lado, 9 mm² ao todo. Cada um guarda 0,1 µL.
- Os 4 quadrados grandes dos cantos são divididos em 16 quadrados de 0,25 mm de lado.
- O quadrado grande do centro é dividido em 25 quadrados médios de 0,2 mm de lado (0,04 mm² cada).
- Cada quadrado médio tem 16 quadradinhos de 0,05 mm de lado (0,0025 mm² cada): são 400 no quadrado central.
- A profundidade, entre a grade e a lamínula, é de 0,1 mm.
As montagens prontas e de onde vêm
Cada montagem é um ponto de partida tirado de manuais de ensino. A diluição e os quadrados mudam de um protocolo pra outro: confira os do seu laboratório e mude os campos, que a conta acompanha.
- Leucócitos: diluição 1:20 e os 4 quadrados grandes dos cantos (4 mm²), ou seja, total × 50. Manual de técnicas básicas de laboratório da Organização Mundial da Saúde (2003, seção 9.6) e apostila de hematologia da Universidade de Berna.
- Hemácias: diluição 1:200 e 5 quadrados médios do quadrado central (0,2 mm², o mesmo que 80 quadradinhos), ou seja, total × 10.000. Aula de contagem de células da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e apostila da Universidade de Berna.
- Plaquetas: 20 µL de sangue em 0,38 mL de oxalato de amônio 1% (diluição 1:20), contadas nos quadrados grandes até passar de 100. No quadrado grande do centro, a conta é total × 200. Manual de laboratório da Federação Mundial de Hemofilia.
- Líquor: claro, sem diluir, contando a área toda de 9 mm², ou seja, total × 10 ÷ 9. Turvo, o manual da Organização Mundial da Saúde dilui 1:20 em líquido de Türk (seção 8.3).
- Espermatozoides: sêmen diluído 1:20 e os 4 quadrados grandes dos cantos, como na contagem de leucócitos (manual da Organização Mundial da Saúde, seção 5.7): total × 50 por µL, ou total × 0,05 milhão por mL.
Dicas pra contar certo
- Espere as células assentarem antes de contar: o manual da Organização Mundial da Saúde pede 3 minutos pros leucócitos e 5 pro líquor. As plaquetas ficam de 10 a 20 minutos numa placa tampada com algodão úmido, pra não secar (Federação Mundial de Hemofilia).
- Não deixe o líquido transbordar pro canal entre as duas grades: se transbordar, limpe a câmara e a lamínula e encha de novo.
- Conte as células que tocam duas bordas do quadrado e deixe de fora as das outras duas. A apostila de Berna conta as da borda esquerda e de baixo.
- Conte pelo menos 100 células (400 nas hemácias, pela apostila de Berna). Com menos, conte mais quadrados ou use uma diluição menor.
- Faça duas diluições e tire a média: as duas contagens devem concordar em até 10% (Federação Mundial de Hemofilia).